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　　組織培養的步驟

　　培養基配制

　　配制培養基有兩種方法可以選擇，一是購買(mǎi)培養基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購買(mǎi)商品的混合好的培養基基本成分粉劑，如MS、B5等。自己配制可以節約費用，但浪費時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問(wèn)題，給實(shí)驗帶來(lái)麻煩。目前國內的情況看，多數還是自己配制。

　　1、配制幾種母液

　　一般配制成100倍MS有機母液。配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。

　　1.1配制MS大量元素母液

　　1.2配制MS微量元素母液

　　1.3配制MS有機母液

　　1.4配制MS鐵鹽母液

　　MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。

　　2、激素母液的配制

　　各種生長(cháng)素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長(cháng)素類(lèi)一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

　　3、配制培養基

　　以配置1L MS培養基為例，按順序進(jìn)行如下操作：

　　3.1先在燒杯中放入一些蒸餾水。

　　3.2分別取上面八種母液10ml倒入。

　　3.3一般稱(chēng)取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。

　　3.4加蒸餾水用量筒定溶至1L。

　　3.5按設計好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長(cháng)至關(guān)重要。所以有條件的話(huà)好用微量可調移液器吸取，減少誤差。

　　3.6用精密試紙或酸度計調整PH至5.7～5.8。（有條件的話(huà)使用酸度計，比較精確） 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來(lái)調溶液PH值。

　　1當量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

　　1當量NaOH配制：稱(chēng)取NaOH 4g 配成100ml溶液。

　　3.7稱(chēng)取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。

　　3.8稍微冷卻后，分裝入培養容器中。無(wú)蓋的培養容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。

　　3.9放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。

　　3.10滅菌后從滅菌鍋中取出培養基，平放在實(shí)驗臺上令其冷卻凝固。

　　滅菌

　　滅菌是組織培養重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀(guān)點(diǎn)，無(wú)菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。

　　這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線(xiàn)菌、藻類(lèi)及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強，條件適宜時(shí)便可大量滋生。

　　無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，高層大氣、巖石內部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內部都是無(wú)菌的。

　　滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過(guò)消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì )完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著(zhù)的微生物，所以通過(guò)嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著(zhù)和手都不帶任何活著(zhù)的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無(wú)菌操作。

　　植物組織培養對無(wú)菌條件的要求是非常嚴格的，甚至超過(guò)微生物的培養要求，這是因為培養基含有豐富的營(yíng)養，稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據不同的對象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(cháng)。

　　常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類(lèi)，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線(xiàn)處理（紫外線(xiàn)、超聲波、微波）、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

　　1．培養基用濕熱滅菌

　　培養基在制備后的24小時(shí)內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。

　　注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開(kāi)放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時(shí)，開(kāi)始計時(shí)，維持壓力0.1～0.15MPa，20分鐘。

　　按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同。如果容器體積較大，但是放置的東西數量很少，也可以減少時(shí)間。